Как устроен ПЦР-анализ

Что общего у производства ГМО-риса и анализа на инфекции? И биотехнологи, и специалисты лабораторной диагностики используют полимеразную цепную реакцию (Polymerase Chain Reaction), или ПЦР. Она позволяет быстро размножить молекулу ДНК и за короткое время получить десятки миллиардов ее копий. За открытие метода американский биохимик Кэри Бэнкс Мюллис в 1993 году получил Нобелевскую премию: благодаря появлению ПЦР стало возможным выполнение генетических исследований, производство некоторых лекарств и улучшение качества продуктов, а еще быстрая и точная диагностика инфекций. В первую очередь речь идет о тех возбудителях, которых трудно или практически невозможно вырастить на питательных средах – например, вирусах.

И смертельно опасные вирусы, и полезные кишечные бактерии, и люди наравне с пушистыми котами, аквариумными рыбками и другими биологическими видами обладают одним схожим качеством – наличием генетической (или наследственной) информации. Это информация о строении, внешнем виде и других свойствах организма, которая передается от поколения к поколению. Внутри клетки она закодирована в виде длинных полимерных молекул – нуклеиновых кислот: ДНК или РНК (у некоторых вирусов).

ДНК – это длинная молекула, которая состоит из двух параллельных нитей (их называют цепями), закрученных в спираль и соединенных между собой прочными водородными связями. В растворе она похожа на тонкие и тягучие прозрачные выделения из носа (мы не будем их назвать, но вы же нас поняли, правда?). Во всяком случае, это первая ассоциация, которая появляется при попытке набрать раствор ДНК в микропипетку.

Внутри организма ДНК постоянно копируется: клетки обновляются, и генетическая информация переходит от старожилов к новичкам. Переписыванием информации занимается фермент ДНК-полимераза. Она может работать только с одной цепочкой, поэтому когда копирование – репликация – происходит в живой клетке, цепи ДНК разъединяют, а потом сшивают обратно специальные белки-ферменты.

Выдрессировать эти белки, чтобы они повторяли свою работу в лабораторных условиях, пока не получилось. Можно разорвать связи между цепями по-другому – нагреть реакционную смесь до 95о С. Проблема в том, что ДНК-полимераза – белок, а структура большинства белков необратимо изменяется при температуре выше 50о С. Это делает невозможным протекание любых биохимических процессов, свойственных живым организмам, в том числе и копирование ДНК. Вернее, почти невозможным…

Thermus aquaticus – бактерии-экстремофилы, которых не покидает ощущение комфорта, даже когда они находятся в воде вулканических гейзеров. Там их впервые и обнаружили ученые в 1975 году. Эти бактерии копируют свою ДНК особенным ферментом – taq-ДНК-полимеразой. Благодаря этому ферменту можно получать точные копии ДНК самых разных организмов в лабораторных условиях.

В лаборатории к образцу биологического материала (им может быть соскоб клеток слизистых оболочек, кровь и другие биологические жидкости) добавляют реагенты. Это буферный раствор с ионами магния; taq-полимераза, которая будет копировать ДНК; строительный материал для воспроизводства цепи – нуклеотиды; праймеры. Праймеры – это очень короткие звенья специфической ДНК возбудителя (то есть характерные только для него). Если в образце биоматериала присутствует возбудитель, праймеры присоединятся к его ДНК и инициируют процесс копирования.

Сам процесс увеличения числа копий ДНК называется амплификацией. Контейнер с аналитом (биоматериал с реагентами) помещают в амплификатор – это такой термостат, который позволяет быстро изменять температуру в заданной последовательности, необходимой для протекания реакции. Полимеразная цепная реакция длится несколько часов и состоит из повторяющихся циклов копирования ДНК.

Результат ПЦР-теста может быть представлен в двух форматах – качественном или количественном. В первом случае ответ может быть отрицательным или положительным (ДНК возбудителя не обнаружена или обнаружена). Во втором положительный результат будет содержать информацию о количестве копий ДНК возбудителя инфекции – это нужно, например, для определения количества условно патогенных микроорганизмов, которые неопасны, пока их немного.

Главные преимущества ПЦР-диагностики инфекций – это скорость, высокая чувствительность и высокая специфичность метода: возможность обнаружить возбудителя, даже если он присутствует в совсем небольшом количестве, и точно его идентифицировать (праймеры одного вида не присоединятся к ДНК другого).